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项目文章 | PP:欧易云平台助力上海交通大学薛红卫教授课题组文章发表

   日期:2024-12-05     浏览:102    移动:http://lanlanwork.gawce.com/mobile/quote/10340.html

项目文章 | PP:欧易云平台助力上海交通大学薛红卫教授课题组文章发表

孔伟博士和谭树堂博士(现为中国科学技术大学特任研究员)为共同第一作者,文章中标记定量蛋白组实验和分析由欧易生物协助完成。特别值得一提的是,文章中多个图片结果均借助于欧易云平台(https://cloud.oebiotech.com)生成。点击文末“阅读全文”即可跳转到欧易云平台哦~近日,上海交通大学薛红卫教授为通讯作者,在 Plant Physiology (IF: 6.902) 期刊在线发表了题为“mRNA Surveillance Complex PELOTA-HBS1 Regulates Phosphoinositide-Dependent Protein Kinase1 and Plant Growth”的研究论文,该研究发现了 PELOTA-HBS1 复合物在植物中的重要调控作用,从而揭示出 mRNA 质量控制的新机制。

 

研究背景

信使RNA (mRNA)的质量和保真度由细胞自主监控,异常的 mRNA 需要被内在的分子机制识别,并自我降解,以防止潜在毒性蛋白的产生。RQC (RNA Quality Control, RNA监测机制) 是一种进化上保守的 RNA 监测机制,根据目前的理解,至少有三种不同的 mRNA 监测机制:无义介导的 mRNA 降解 (nonsense-mediated decay, NMD)、无终止降解 (non-stop decay, NSD) 和翻译停滞降解 (no-go decay, NGD)。NMD 和 NSD 分别以过早终止密码子 (过早终止) 和缺乏终止密码子 (终止失败) 为靶标。NGD 针对在翻译延伸过程中停滞的 mRNA,例如那些具有二级结构或修饰的 mRNA。然而,到目前为止,人们对植物中的 mRNA 质量控制知之甚少。

 

研究内容

3’-磷脂酰肌醇依赖蛋白激酶1 (PDK1) 是真核生物生长发育过程中必不可少的主要调控因子。PDK1 功能缺失突变体会导致动物和酵母致死缺陷,但是在拟南芥中仅会引起轻微的表型缺陷。本研究为了阐明 PDK1 的分子机制,采用正向遗传方法筛选拟南芥中功能缺失的 T-DNA 插入双突变体 pdk1.1 pdk1.2的抑制子。pdk1.1 pdk1.2 生长缺陷的表型能够被 sop21 恢复,该抑制子是由 PELOTA1 (PEL1) 基因功能缺失所致。进一步遗传分析表明,功能缺失的 PEL1-HBS1 复合体不能降解被 T-DNA 破坏的 PDK1 转录本,从而挽救了 pdk1.1 pdk1.2 的生长发育缺陷。

 

本研究证实了一个同源的 PELOTA-HBS1 复合物的功能,这种复合物能够降解异常 RNA,确保翻译过程中 mRNA 分子的质量和保真度。本研究为深入了解 mRNA 监控从而控制蛋白质的动态平衡提供了新见解。

 

研究结果

1. PEL1 缺陷挽救了拟南芥 pdk1.1 pdk1.2 的生长缺陷

拟南芥 pdk1.1 pdk1.2 双突变体表现为明显的发育缺陷,包括生长抑制、腋芽减少、初生根伸长和侧根萌发的抑制、育性降低、花发育异常等(图 1)。采用正向遗传学手段,对上述双突变体进行 EMS 诱变,从 M2 群体中分离得到一个明显挽救了 pdk1.1 pdk1.2 缺陷表型的隐性突变体 sop21。利用 102 株 F2 个体的 BSA 混池测序,鉴定到 sop21 突变体是由 PEL1 基因的功能缺失突变所导致的,并通过 T-DNA 插入缺失和过表达得以证实。 

图 1 | PEL1 突变挽救了拟南芥 pdk1.1 pdk1.2 双突变体生长缺陷的表型

 

2. 拟南芥中 mRNA 监控复合物 PELOTA-HBS1 的存在

PEL1 是哺乳动物 PELOTA 和酵母 DOM34p 的同源物,两者都可与 GTPase HBS1 形成异源二聚体复合物,这种复合物负责核糖体拯救,从而确保翻译过程中 mRNA 分子的质量和保真度。利用酵母双杂交、BiFC、GST-pull down 实验证实(图 2),拟南芥中的 PEL1 可以与 HBS1 在体内和体外发生相互作用。同样,hbs1 敲除突变体也表现出对 pdk1.1 pdk1.2 生长缺陷表型的恢复(图 1 A-B)。表明在拟南芥中也存在功能性的 PELOTA-HBS1 复合物。 

图 2 | PEL1 与 HBS1 形成复合物

 

3. PELOTA-HBS 复合物调节 PDK1 异常转录本的降解

对于 pdk1.1 pdk1.2 突变体、pdk1.1 pdk1.2 sop21 突变体、pdk1.1 pdk1.2 pel1 突变体、pdk1.1 pdk1.2 hbs1 突变体中,利用跨越 T-DNA 的引物进行 RT-PCR,结果显示其中 PDK1.1 和 PDK1.2 均没有表达(图 A-B);利用 T-DNA 插入位置之前的引物进行 RT-PCR,相比于双突变体,三突变体中截短的 PDK1.1 和 PDK1.2 转录本的表达量均有所恢复(图 C-D)。并且,在 pdk1.1 pdk1.2 突变体转入表达 PDK1.1 或 PDK1.2 5’ N 端截短蛋白的载体,同样可以引起缺陷表型的恢复(图 E)。

以上结果表明,pel1 和 hbs1 突变体可能通过破坏 PELOTA-HBS 监控复合物,以上调异常截短的 PDK1.1 和 PDK1.2 N 转录本的总量,进而挽救缺陷表型。 

图 3 | pdk1.1 pdk1.2 pel1 或 pdk1.1 pdk1.2 hbs1 背景中截短的 PDK1 转录本的表达增加导致了表型挽救

 

4. PDK1 通过协调多种代谢途径以调控发育和应激响应

标记定量蛋白组检测显示,野生型、pdk1.1 pdk1.2 双突变体、pdk1.1 pdk1.2 pel1 三突变体间存在大量差异表达蛋白质。

 

在双突变体中表达发生改变、而在三突变体中恢复至野生型水平的差异蛋白(restored commonly expressed, RCE),推测与表型恢复有关。对 RCE 蛋白的 KEGG 富集分析显示,这些蛋白参与了多个代谢通路。同样大量与病原体防御、系统获得性抗性、非生物胁迫响应相关的蛋白也出现了富集。 

图 4 | 野生型、双突变体、三突变体间差异蛋白比较

 

研究结论

本研究阐明了拟南芥中 PEL1-HBS1 复合物进行 mRNA 质量监控的新机制:

1) PEL1-HBS1 复合物通过调控核糖体以维持正常蛋白质的翻译和植物生长;

2) pdk1.1 pdk1.2 突变中,由于 T-DNA 的插入,导致 PDK1 转录本被截短而异常转录,监控复合物识别并降解这些异常转录本,导致表型缺陷;

3) sop21 突变使得监控复合物被破坏,因而 PDK1 异常转录本得以保留,从而引起了缺陷表型的恢复。

 

参考文献

Kong W, Tan S, Zhao Q, et al. mRNA Surveillance Complex PELOTA-HBS1 Regulates Phosphoinositide-Dependent Protein Kinase1 and Plant Growth. Plant Physiol 2021; doi: 10.1093/plphys/kiab199.

 

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